FLIM成像-成像新概念

HORIBA FLIMera相機(jī)是FLIM技術(shù)的一個(gè)新概念。它是一個(gè)寬場(chǎng)成像相機(jī)，而不是一個(gè)共焦點(diǎn)掃描系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是可以用簡(jiǎn)單的攝像技術(shù)在視頻速率下研究FLIM動(dòng)態(tài)。

FLIMera 視頻 (1:43)

概要：

• 每個(gè)像素的TCSPC架構(gòu)可同時(shí)提供24,576衰減曲線

• 復(fù)雜的多組份壽命研究

• 直接獲取衰減動(dòng)力學(xué)

• 可實(shí)現(xiàn)多達(dá)5個(gè)指數(shù)的衰減曲線分析

• EzTime Image --- 簡(jiǎn)單而高效的軟件界面

• 適用于復(fù)雜和精密的分子分析，如活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究和疾病診斷的生物標(biāo)志物檢測(cè)

CMOS技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了基于像素陣列的成像傳感器的發(fā)展，每個(gè)像素基于一個(gè)時(shí)間數(shù)字轉(zhuǎn)換器（TDC），包含一個(gè)單光子雪崩光電二極管（SPAD）及其相關(guān)的電子計(jì)時(shí)裝置。

這使得基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)（TCSPC）的快速（視頻速率）熒光壽命測(cè)定在每個(gè)像素中得以獨(dú)立實(shí)現(xiàn)（圖1）。

圖1：SPAD和TDC對(duì)

一個(gè)192 x 128像素的圖像傳感器，采用40nm CMOS技術(shù)，被整合到一個(gè)寬視場(chǎng)外延熒光顯微鏡裝置中。該傳感器具有13%的填充因子，每個(gè)18.4 x 9.2 μm的像素包含一個(gè)分辨率<40 ps的TDC。從而可同時(shí)進(jìn)行24,576次熒光壽命測(cè)量，每次測(cè)量包含4,096個(gè)時(shí)間段。通過專用固件和HORIBA EzTime Image軟件，熒光強(qiáng)度和平均壽命以及TCSPC成像測(cè)量產(chǎn)生的相位圖可以同時(shí)以視頻（>30 fps）速率實(shí)時(shí)顯示（圖2）。

 圖2：同時(shí)呈現(xiàn)的四個(gè)數(shù)據(jù)集

操作模式

FLIMera是為配合HORIBA高度直觀的EzTime Image軟件使用而設(shè)計(jì)的。該軟件用于FLIMera的控制、數(shù)據(jù)采集和分析。FLIMera提供4種操作模式。

• 手動(dòng)  – 用戶開始和停止采集，提供TCSPC強(qiáng)度圖像和用于壽命分析的FLIM數(shù)據(jù)。

• 定時(shí)– 用戶定義采集的運(yùn)行時(shí)間，提供TCSPC強(qiáng)度圖像和用于壽命分析的FLIM數(shù)據(jù)。

• 流向HDF5文件 – TCSPC數(shù)據(jù)可以在用戶確定的時(shí)間段內(nèi)流向一個(gè)HDF5文件，包含了每個(gè)像素中每個(gè)光子的完整記錄，無數(shù)據(jù)丟失，并可用于重建幀以進(jìn)行完全衰減分析。

• 相位圖 – 對(duì)直方圖的補(bǔ)充，能夠以相位圖的形式實(shí)時(shí)顯示和選擇壽命數(shù)據(jù)，如圖3所示。相位圖需要使用標(biāo)準(zhǔn)樣品壽命進(jìn)行初始校準(zhǔn)。

圖3：相位圖 

使用標(biāo)準(zhǔn)樣品和FUN-1標(biāo)記的酵母細(xì)胞展示其視頻速率（圖4）。

 圖4：從FUN-1標(biāo)記的酵母細(xì)胞壽命視頻中提取的一系列圖像 https://youtu.be/1Fu7VOCsHuA

 圖5 a: DeltaFLEX液體樣品的衰減

圖5 b：來自24,578個(gè)SPAD像素中的一個(gè)的衰減，顯示了FLIMera非常高的分辨率和TCSPC的真實(shí)性。

FLIM 和 HORIBA

新穎的像素內(nèi)檢測(cè)和計(jì)時(shí)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了寬視場(chǎng)成像方法，這大大減少了數(shù)據(jù)采集時(shí)間，使動(dòng)態(tài)事件的研究成為可能。FlIMera為HORIBA在熒光測(cè)量領(lǐng)域做出了貢獻(xiàn)；它獲得了著名的物理學(xué)會(huì)商業(yè)創(chuàng)新獎(jiǎng)。